高清妍 朱阳敏 胡靖 郭洁 鲍本霖 赵馨 叶蕾 李园 彭广新 李建平 李洋 樊慧慧 宋琳 井丽萍 张莉 张凤奎

中国医学科学院血液病医院　北京协和医学院血液学研究所，天津　300020

通信作者：张凤奎，Email: zhfk@hotmail.com

　　摘要目的

　　评估真性红细胞增多症（PV）患者的红细胞寿命，探讨其影响因素。方法 连续纳入2017年2月至2018年12月中国医学科学院血液病医院确诊的27例PV患者，以同期18例健康志愿者为正常对照，采用内源性一氧化碳呼气试验方法检测红细胞寿命，行相关性分析评估其影响因素。结果 27例PV患者中位红细胞寿命为80（35~120）d，较正常对照组的110.5（69~166）d明显缩短（P<0.05），平均缩短35.3 d。10例初诊PV患者红细胞寿命为98（35~117）d，17例正在行羟基脲和/或干扰素药物治疗者的红细胞寿命为69（45~120）d，两组红细胞寿命均较正常对照缩短（P=0.010，0.000）。相关性分析显示，初诊PV患者的红细胞寿命与JAK2突变基因负荷量呈正相关（r=0.900，P=0.037），与外周血淋巴细胞计数（r=-0.742，P=0.014）及血清维生素B₁₂水平（r=-0.821，P=0.023）呈负相关。结论 PV患者红细胞寿命较健康者缩短约1/3，且与JAK2突变基因负荷量、淋巴细胞计数、血清维生素B₁₂水平相关。

　　【关键词】 红细胞增多症，真性 ；红细胞寿命 ；一氧化碳呼气试验

　　DOI:10.3760/cma.j.issn.0578-1426.2019.10.010

　　Red blood cell lifespan detected by endogenous carbon monoxide breath test in patients with polycythemia vera

　　Gao Qingyan;Zhu Yangmin;Hu Jing;Guo Jie;Bao Benlin;Zhao Xin;Ye Lei;Li Yuan;Peng Guangxin;Li Jianping;Li Yang;Fan Huihui;Song Lin;Jing Liping;Zhang Li;Zhang Fengkui(Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Tianjin 300020,China

　　Corresponding author:Zhang Fengkui,Email:zhfk@hotmail.com

　　【Abstract】 Objective To detect the red blood cell lifespan in patients with polycythemia vera (PV), and explore the influencing factors. Methods From February 2017 to December 2018, 27 patients with PV at Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Science and 18 normal controls were recruited. Red blood cell lifespan was detected by endogenous carbon monoxide (CO) breath test. The related factors were analyzed. Results The average red blood cell lifespan of 27 PV patients was 80 (range, 35-120) days (d), which was significantly shorter than that of the normal controls [110.5(69-166) d, P<0.05], namely 35.3 d shorter. The red blood cell lifespan of ten newly diagnosed patients and 17 patients who were treated with hydroxyurea and/or interferon were 98 (35-117) d and 69 (45-120) d, respectively, which were both shorter than that of the normal control (P=0.010, 0.000). Correlation analysis showed that red blood cell lifespan of patients with newly diagnosed PV was associated with JAK2 mutation allele burden (r=0.900, P=0.037), peripheral blood lymphocyte count (r=-0.742, P=0.014) and the level of serum vitamin B₁₂ (r=-0.821, P=0.023). Conclusion The lifespan of red blood cells in patients with PV is about one?third shorter than normal, and is related to JAK2 mutation allele burden, absolute lymphocyte count, and serum vitamin B₁₂ level.

　　【Key words】 Polycythemia vera Red blood cell lifespan Carbon monoxide breath test

　　DOI:10.3760/cma.j.issn.0578-1426.2019.10.010

　　真性红细胞增多症(polycythemia vera , PV)是起源于骨髓造血干细胞的慢性获得性骨髓增殖性肿瘤 (myeloproliferative neoplasms , MPN)，其特征是外周血成熟红细胞和/或自细胞、血小板异常增多，并伴血勃滞性增高和髓外造血，发生骨髓纤维化和白血病转化倾向增高^[1-2]。研究表明，绝大多数PV发病与JAK2基因V617F突变相关^［3］，JAK2基因编码区第1 849位核昔酸由G点突变为T，致使 Janus 激酶 2 蛋白第 617 位氨基酸 频氨酸被替代为苯丙氨酸，引起细胞自发酷氨酸磷酸化、JAK/STAT通路激活，促进造血祖细胞 对红细胞生成素 （erythropoietin , EPO） 等造血调控因子反应^［3］。另外 ，近年发现 JAK2 基因12号外显子、MPL及CALR等基因突变也与PV发病相关。

　　尽管 MPN 患者过量生成的外周血细胞形态大致正常，但对原发性血小板增多症患者的研究发 现，初诊时其外周血血小板寿命较正常人缩短 ，即使经白消安治疗后血小板计数恢复正常，其血小板寿命仍明显缩短^［4］。因而，形态正常的MPN血细胞质量仍可能有异于正常血细胞。我们应用快速内源性 co 呼吸试验检测 PV 患者的红细胞寿命^［5］，以期探究PV病理机制及红细胞代谢动力学。

　　对象与方法

　　1.研究对象：连续纳入2017年2月至2018年12月中国医学科学院血液病医院贫血诊疗中心收治并确诊的27例PV患者。所有患者均经仔细询问病史、体格检查，完善外周血细胞计数和涂片分类、肝肾功能、动脉血气分析、骨髓穿刺涂片、骨髓活检切片病理细胞学分析和网状纤维染色、JAK2基因12及14号外显子、CALR基因9号外显子、MPL基因10号外显子突变分析、BCR/ABL融合基因检测、血清EPO水平测定等检查，除外继发性红细胞增多病因，符合PV诊断标准^［6］正常对照组18例，为健康体检者，既往无慢性病史及异常体格检查体征，血常规、肝肾功能、心肺功能、尿粪常规检查均无异常，且在纳人研究之前至少8周内无急性疾病、用药史、吸烟史。

　　2.红细胞寿命测定：采用内源性co呼气试验方法检测红细胞寿命^［5］,RBCS-01型红细胞寿命测定仪由深圳先亚生物科技有限公司生产。采气前24h内严禁吸烟，采气时间限定在清晨起床8:00至12:00，受检者保持空腹、静息状态。采气时受试者首先深吸气，屏气10s以上，随之口含密封铝筒肺泡气收集袋的单向导气管深呼气，去除呼吸道死腔气体后，收纳呼出气；同时，于动气泵采集同室空气样本。2份气样同时送检，上机测定co浓度。仪器操作严格按照仪器使用说明进行。所有患者及正常对照红细胞寿命均重复测量2次，取平均值。

　　3.统计学处理：数据采用SPSS25.0软件进行统计分析。计数资料以例数和百分比表示，采用卡方检验进行分析；对于计量资料，统一以M（范围）表示。符合正态分布的资料采用t检验，非正态分布资料采用秩和检验进行分析。采用Pearson法（正态分布）或Spearman法（非正态分布）进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　结果

　　1.两组基本情况：27例PV患者，男15例，女12例，中位年龄64(27~79）岁。JAK2基因突

　　变阳性者22例（81.5%），突变基因负荷量中位值为54.60%(0.37%~84.94%）;JAK2、CALR、MPL基因突变均阴性者5例（18.5%）。JAK2突变中，21例为JAK2 V617F突变，1例为JAK2Exon12突变（p.E543-D544del）。27例患者在接受红细胞寿命检查时，10例为初诊未经任何治疗干预患者，17例为院外疑诊并已行药物（羟基脲和/或干扰素）干预治疗，两组患者血红蛋白水平的差异无统计学意义（P=0.180）。27例患者基线情况见表1。18例正常对照，男5例，女13例，年龄37(25～64）岁，血红蛋白138(117～157)g/L。

　　2.红细胞寿命测定（图1～4）:27例PV患者应用内源性CO呼气试验测得红细胞寿命为80(35～120)d,而正常对照组红细胞寿命为110.5(69～166)d,PV患者红细胞寿命较正常对照明显缩短（P=0.000），平均缩短35.3d，约为正常红细胞寿命的1/3。22例JAK2突变者红细胞寿命为77(43～120)d，其中21例JAK2 V617F突变者为74(43～120)d,1例JAK2 Exonl2突变者为83d;5例JAK2,CALR、MPL基因突变均阴性的PV患者红细胞寿命为100(35～117)d。10例初诊患者红细胞寿命为98(35～117)d,17例药物治疗干预者红细胞寿命为69(45～120)d，两组比较差异无统计学意义（P=0.243）；与正常对照比较，初诊和药物治疗干预的PV患者的红细胞寿命均明显缩短（P=0.010,0.000）。

　　3.影响红细胞寿命的相关因素分析：我们分析10例未经治疗干预的初诊PV患者红细胞寿命相关因素显示，PV红细胞寿命与其JAK2突变基因负荷量（r=0.900,P=0.037）呈正相关，与外周血淋巴细胞计数（r=-0.742,P=0.014）和血清维生素B₁₂水平（r=-0.821,P=0.023）呈负相关；与患者性别、现实年龄、初始发病年龄、病程时间（发现红细胞增多／症状出现至红细胞寿命检测时间）、外周血臼细胞计数、红细胞计数、血小板计数、血红蛋白浓度、血细胞比容、网织红细胞绝对值、高荧光网织红细胞比例、总胆红素、间接胆红素、细胞因子水平（包括IL-1β,IL-2R,IL-6、IL-8、IL-10）、血清EPO浓度、可熔性转铁蛋白受体浓度及脾脏肿大程度无相关性。

　　内源、性co呼气试验检测红细胞寿命的原理是基于快速检测肺泡呼出气体中 co浓度可反映即时机体红细胞血红蛋白分解，以间接推算红细胞活存情况 ^[7] Zhang等^[5] 采用该方法检测正常人红细胞寿命为（126±26)d（范围82～215d），与传统标记法检测结果范围相当，而溶血性贫血患者红细胞寿命明显缩短[(29±14)d］。本研究应用内源性CO呼气试验法测得18例正常对照红细胞寿命为110.5(69～166)d，与文献报道的正常人红细胞寿命一致^[5]，进一步验证本方法可行 、结果可靠。

　　早在半世纪前，即有研究应用标记法检测红细胞增多症的红细胞寿命。London和Shemin^[7]应用¹⁵N甘氨酸标记法检测1例PV患者的红细胞寿命，显示为正常（131d）。Huff等^［8］应用放射活性⁵⁹Fe检测未治疗的PV患者及经放射性同位素治疗后未达满意疗效的PV患者铁代谢转换率，是正常对照5倍，红细胞铁更新速率远快于机体循环红细胞数增长，提示此部分PV患者体内存在红细胞寿命缩短；而检测继发性红细胞增多症患者铁周转率为正常2倍，但其接近根据患者红细胞数增长值推测的铁转换率。Johnson等^［9］应用⁵¹Cr也发现PV患者红细胞寿命缩短。本研究首次报道应用内源性co呼气试验检测PV红细胞寿命为80(35～120)d，较正常对照明显缩短，平均缩短35.3cl。将治疗干预因素排除，在初诊患者仍显示红细胞寿命较正常明显缩短，这与既往多数采用标记法的检测结果一致。

　　虽然不同方法检测PV患者红细胞寿命多提示较正常缩短，但引起红细胞寿命缩短的原因尚不十分明确。内游、性co呼气试验检测的是机体整体红细胞即时血红蛋白分解，并不能专一地检测PV JAK2突变克隆生成的红细胞或正常红细胞。就红细胞自身改变而言，本研究相关性分析显示初诊PV患者红细胞寿命与JAK2基因突变负荷量呈正相关（r=0.900,P=0.037），而非明显负相关，至少提示红细胞寿命缩短并非主要是由JAK2突变造血干细胞克隆生成红细胞异常所致。尽管Berlin等^［10]应用¹⁴C甘氨酸标记红细胞确实发现PV患者体内存在寿命接近正常和明显缩短两群明显不同寿命的成熟红细胞，但未能证实寿命缩短的红细胞群的确切来源。而Bogdanova等^［11］在红细胞增多症小鼠中证明新生红细胞比例增高，Bartos和Desforges^[12]通过检测PV患者红细胞酶学的变化，也发现葡萄糖6磷酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶等在“较年轻”红细胞中活性较高的酶在PV患者中活性亦明显升高，提示PV患者体内红细胞群体可能较为“年轻”，但尚不清楚酶活性改变的红细胞来源及是否寿命缩短。本研究同样显示高荧光网织红细胞、可溶性转铁蛋白受体等标志新生红细胞生成增多指标与PV患者红细胞寿命无相关性。此外，Avissar等^［13]检测了32例PV患者细胞氧化还原酶活性，发现酶活性表现为缺陷的仅有谷胱甘肽还原酶 (glutathione reductase,GR），体外引入其辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide,FAD）后，GR活性可恢复正常，推测过度红系造血或放血治疗导致红细胞内FAD或其前体核黄素缺乏，可能导致红细胞寿命缩短。我们的研究显示PV患者的红细胞寿命与造血原料含量无相关性，而初诊者红细胞寿命与血清维生素B₁₂水平呈负相关，但维生素B₁₂与红细胞寿命如何相互影响尚不明确。

　　除红细胞自身改变外，单核巨噬系统对红细胞吞噬作用增强也可使红细胞寿命缩短。Bogdanova等^［11］发现红细胞增多症tg6小鼠体外巨噬细胞活性明显强于野生型，tg6小鼠红细胞更易被巨噬细胞捕获，体内示踪发现肝脏巨噬细胞吞噬红细胞显著增加。本研究结果显示红细胞寿命缩短与患者脾脏大小无关，提示红细胞清除及巨噬细胞活性与脾脏大小不成比例。因缺乏有效评价肝脏大小的指标，我们未能证实肝脏对红细胞寿命的影响。此外，研究发现IFNγ等炎症细胞因子可引起单核巨噬细胞系统激活，使红细胞被过多吞噬、分解，红细胞寿命缩短^［14-15］这提示红细胞寿命可能与机体炎症反应有关。我国学者亦发现，IL-2受体、IL-6、IL-8等淋巴细胞因子水平升高可能与再生障碍性贫血红细胞寿命缩短有关^[16] 。我们对初诊PV患者的红细胞寿命进行相关因素分析，结果显示患者红细胞寿命与外周血淋巴细胞计数（r=-0.742,P=0.014）呈负相关，但未发现其与包括IL-113、IL-2受体、IL-6、IL-8、IL-10等在内的细胞因子水平等炎症介质存在相关性。鉴于样本数量限制，我们未进行红细胞寿命与各淋巴细胞亚群相关性分析，无法证实炎症细胞及其介质对PV患者红细胞寿命的影响。

　　Pollycove等^［17］通过铁代谢动力学分析，认为PV红细胞寿命随病程发展可由正常变为缩短，患者白细胞、血小板亦存在随病程发展寿命缩短的现象，推测PV自然病程可能是具有生存优势的功能性改变的造血干细胞克隆性扩增的结果。然而，本研究结果未提示PV红细胞寿命与病程时间相关，且初诊患者红细胞寿命与基因突变负荷量呈正相关，故PV病程发展中的红细胞寿命变化尚需进一步研究。另外，需注意的是本研究中PV组患者中位年龄为64(2779）岁，相关性分析显示患者红细胞寿命与年龄无关，既往研究显示红细胞寿命不受年龄影响，故我们采用了血液学正常的中青年健康体检者作为正常人红细胞寿命对照。未来，扩大不同年龄亚组正常人及PV疾病组样本量应该可获得更多确证。

　　Bogdanova等^［11］曾通过EPO过表达引起tg6小鼠出现红细胞增多表型，发现小鼠红细胞中加速老化标志物增多，红细胞寿命缩短（比野生型鼠缩短70%），提示红细胞加速老化、寿命缩短可能是机体对红细胞绝对数量增加作出的代偿性反应。PV患者出现红细胞寿命缩短可能亦是机体对JAK2突变引起红细胞生成绝对增加作出的适应性代偿。

　　另外，正在起羟基脲/干扰素药物治疗的PV患者的红细胞寿命为69(45～120)d，似较初诊患者的红细胞寿命98(35～117)d更短，提示羟基脲、干扰素等药物干预可能进一步缩短红细胞寿命。推测羟基脲/干扰素治疗除可通过抑制骨髓增殖引起血细胞生成减少，似乎还可通过缩短成熟红细胞寿命降低PV患者的血细胞压积。

　　我们首次报道内源性co呼气试验检测PV患者的红细胞寿命较正常人缩短约1/3,PV外周血血红蛋白明显增高可能主要是红细胞生成增加而非寿命延长所致。缩短红细胞寿命或是机体代偿性减少过量红细胞生成的代偿性反应。

　　利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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（收稿日期：2019-04-29)

（本文编辑：沈志伟）

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