红细胞寿命是指红细胞在循环血液中的存活时间。正常人红细胞寿命为70~140 d，平均为115 d^[1,2]，衰老红细胞由网状内皮系统非随机清除。重型/极重型再生障碍性贫血（SAA/VSAA）包括红细胞在内的三系血细胞绝对数量的减少源于极度的骨髓造血衰竭^[3]，而其成熟红细胞寿命是否改变以及免疫抑制治疗（IST）对红细胞寿命有何影响却少有报道。本研究中，我们采用无创测定内源性一氧化碳（CO）的呼气试验对51例初诊未治和77例免疫抑制治疗（IST）后的SAA/VSAA患者的红细胞寿命进行了检测，现报道如下。

病例与方法

1.　病例：

以2016年11月至2017年4月于中国医学科学院血液病医院贫血诊疗中心就诊的128例SAA/VSAA患者为研究对象，男80例，女48例，中位年龄23（6~66）岁。AA诊断参照国际粒细胞减少与AA研究组1987年标准^[4]，严重程度分型参照Camitta等1976年标准^[5]和Bacigalupo等1988年标准^[6]。肝炎相关性AA（HAAA）定义为与肝炎同时或在肝炎患病6个月内发生的AA，血清转氨酶水平至少达200 U/L^[7]。患者治疗前均明确诊断及分型，并经仔细询问病史、查体、常规细胞遗传学检查、Ham试验及流式细胞术检测嗜水气单胞菌溶素变异体（Flaer）表达排除低增生性骨髓增生异常综合征（MDS）及阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）。40岁以下患者常规进行彗星试验、丝裂霉素试验等除外先天性骨髓造血衰竭。51例为初诊未治且未接受红细胞输注患者，为初诊组；77例为IST后至少6个月、可评价IST疗效的患者，为IST组。

以13例健康志愿者为正常对照，男3例，女10例，中位年龄36（28~47）岁，中位HGB 134（117~158）g/L。

2.　红细胞寿命测定：

采用测定内源性CO呼气试验方法检测红细胞寿命，RBCS-01型红细胞寿命测定仪为深圳先亚生物科技有限公司产品。采气时间限定在8∶00至12∶00，采气前24 h内禁止受检者吸烟，采气时受检者保持空腹、静息状态。采气流程：受检者首先深吸气，屏气20 s，随之含住密封铝箔肺泡气收集袋的单向导气管并深呼气；收纳受检者呼出气的同时以手动气泵采集同室空气样本，上机测定CO浓度，并计算红细胞寿命。

3.　细胞因子测定：

取SAA/VSAA患者外周血5 ml，应用固相、夹心法化学发光免疫法检测IL-2受体（IL-2R）、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平，试剂盒购自德国西门子公司，严格按照试剂盒说明进行操作。

4.　治疗方法：

初诊组患者检测红细胞寿命前未接受任何治疗。IST组患者治疗方法包括：兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（r-ATG）+环孢素A（CsA）治疗6例（7.8%），猪抗人淋巴细胞免疫球蛋白（p-ALG）+CsA治疗67例（87.0%），环磷酰胺（CTX）+CsA治疗1例（1.3%），单用CsA治疗3例（3.9%）。具体用法：r-ATG 3.5 mg·kg^-1·d^-1，静脉滴注，第1~5天；p-ALG 20 mg·kg^-1·d^-1，静脉滴注，第1~5天；CTX 30 mg·kg^-1·d^-1，静脉滴注，第1~4天；CsA以3 mg·kg^-1·d^-1分2次口服起始，ATG/ALG输注结束后第1天开始，维持CsA血清谷浓度150~250 μg/L。获得治疗反应前予G-CSF、红细胞输注及血小板输注等支持治疗，红细胞寿命测定时间与末次输血时间至少间隔2周。

5.　疗效判定及随访：

疗效评定参照英国血液学标准委员会标准修订，并增加良好部分治疗反应（GPR）标准，具体参照文献[8]。完全治疗反应（CR）、GPR、部分治疗反应（PR）均为获得治疗反应（HR）。IST后每3个月进行血细胞分析、骨髓细胞形态学、细胞遗传学检查及外周血细胞锚连蛋白等检测评定疗效，随访截至2017年10月1日。

6.　统计学处理：

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。一氧化碳浓度及红细胞寿命以均数±标准差表示，采用独立样本t检验进行组间比较。其他连续变量以中位数（范围）表示，采用Mann-Whitney U检验进行组间比较。分类变量采用卡方检验或Fisher精确概率法进行比较。采用Spearman相关分析比较细胞因子与红细胞寿命的相关性。应用ROC曲线探索初诊患者红细胞寿命预测IST治疗反应的界值。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.　患者一般临床特征：

128例SAA/VSAA患者中，男80例，女48例，中位年龄23（6~66）岁。初诊组51例、IST组77例。77例IST组患者疗效反应：CR 40例（51.9%）、GPR 11例（14.3%）、PR 17例（22.1%）、未获得治疗反应（NR）9例（11.7%）。两组患者一般临床特征比较见表1。

表1

128例重型/极重型再生障碍性贫血（SAA/VSAA）患者一般临床特征

2.　初诊SAA/VSAA患者红细胞寿命：

见表2。未经输血支持的51例初诊SAA/VSAA患者红细胞寿命为（50.69±21.43）d，与正常对照红细胞寿命[（111.85±31.55）d]相比较明显缩短（t=-6.611，P<0.001）。中位缩短61.20（50.69~111.85）d，约为正常对照红细胞寿命的45.3%。

表2

初诊及免疫抑制治疗（IST）后重型/极重型再生障碍性贫血患者红细胞寿命比较（±s）

3．IST对SAA/VSAA患者红细胞寿命的影响：

77例IST组患者红细胞寿命为（87.14±39.28）d。HR患者红细胞寿命为（92.00±38.60）d，较初诊组患者明显延长（t=7.430，P<0.001），而与正常对照组相近（t=-1.743，P=0.085）；其中CR者红细胞寿命为（106.15±32.12）d，与正常对照者一致（t=-0.558，P=0.579）；GPR者为（74.09±39.19）d，PR者为（70.29±39.28）d，分别较初诊患者红细胞寿命延长23.4 d和19.6 d；未获得治疗反应（NR）患者红细胞寿命为（50.44±21.56）d，与初诊患者相比差异无统计学意义（t=-0.032，P=0.975），与HR患者相比则明显缩短（t=-4.846，P=0.002）（表2）。

4．SAA/VSAA患者红细胞寿命缩短的原因：

单因素分析结果见表3。初诊组51例患者性别（男/女）、年龄（≤14岁/>14岁）、病因（HAAA/原发性AA）、严重程度分型（SAA/VSAA）、外周血细胞参数及是否伴发PNH克隆等因素对红细胞寿命均无明显影响。相关性分析结果显示，初诊SAA/VSAA患者血清IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等细胞因子水平与红细胞寿命均无明显相关性（r_s分别为-0.183、-0.132、0.085、0.183、-0.011，P值分别为0.213、0.372、0.565、0.213、0.943）。

表3

影响初诊重型/极重型再生障碍性贫血（SAA/VSAA）患者红细胞寿命的单因素分析（±s）

5．HR与否血清细胞因子水平比较：

见表4，HR的68例较NR的9例患者血清IL-2R和IL-6水平明显减低（P值均<0.05），IL-8、IL-10和TNF-α水平差异无统计学意义（P值均>0.05）。

表4

重型/极重型再生障碍性贫血（SAA/VSAA）患者免疫抑制治疗获得治疗反应与否血清细胞因子水平比较[M（范围）]

6.　治疗前患者红细胞寿命与IST疗效的关系：

初诊组51例患者中38例后续接受IST并评价3个月疗效，其中HR 16例（42.1%），NR 22例（57.9%）。应用ROC曲线分析治疗前患者红细胞寿命不同界值对IST疗效的预测作用，其cut-off值为60 d，曲线下面积为0.693（95%CI 0.525~0.861，P=0.044），阳性预测值和阴性预测值分别为66.7%和65.6%，敏感性和特异性分别为37.5%和86.4%。38例患者中9例治疗前红细胞寿命>60 d，IST后3个月HR 6例，NR 3例；29例治疗前红细胞寿命≤60 d，IST后3个月HR 10例，NR 19例，两组构成比差异无统计学意义（P=0.128）。

讨论

除了由于血小板明显减少可能合并出血外，AA患者贫血的发生通常被认为缘于残存造血细胞减少，骨髓造血衰竭。本研究我们采用检测内源性CO生成的呼气试验研究初诊和IST后获得不同血液学反应的SAA/VSAA患者红细胞寿命，结果表明初诊SAA/VSAA患者残存造血生成的红细胞寿命明显缩短，IST后6个月HR者红细胞寿命可恢复正常。本研究我们首次详细报道了SAA/VSAA患者红细胞寿命和IST疗效的关系，有助于更为详尽理解SAA/VSAA病理生理机制和红细胞动力学变化。

早在1918年Ashby就通过差异凝集实验发现正常人红细胞寿命约为120 d^[9]。此后，多种的红细胞寿命测定方法陆续研发，包括15N-甘氨酸^[10]、⁵¹Cr^[11]、生物素^[12]等红细胞标记直接测定法，根据血红蛋白更新速率测算的CO呼气试验^[13,14]及基于网织红细胞绝对值的红细胞寿命快速测算方法^[15]等间接测定法。这些不同方法测定或推定的正常人红细胞寿命与Ashby结果相似。然而，除CO呼气试验外，其他方法测定红细胞寿命多耗时长、需多次采集血液样本、含有放射性同位素以及基于机体生理状况和骨髓造血长时间稳定计算，因此难以适用于包括SAA在内的急性、重症疾病患者。CO呼气试验无创、快捷、经济、与红细胞标记法结果高度吻合^[14]，可满足不同生理和病理状态下红细胞寿命测定，本研究我们即采用该方法进行红细胞寿命检测。

文献报道显示，采用⁵¹Cr标记法在慢性再生障碍性贫血（CAA）患者中测得的红细胞半寿期均较正常对照缩短^[16,17,18]，大多轻度缩短，少数患者红细胞半寿期正常。迄今尚缺乏SAA/VSAA患者红细胞寿命相关研究资料。本研究显示，在初诊未输血的SAA/VSAA患者中，红细胞寿命为（50.69±21.43）d，较正常对照[（111.85±31.55）d]明显缩短（t=-6.611，P<0.001），中位缩短61.20（50.69~111.85）d，约为正常对照红细胞寿命的45.3%。该结果与前期文献报告AA患者红细胞半寿期缩短结果相一致，而寿命缩短程度似乎更为明显。鉴于本研究纳入患者均为初诊SAA/VSAA，且采用与以往不同的检测方法，其红细胞寿命是否确实较非重型AA患者者更短需应用相同检测方法纳入不同患者进一步验证。

我们对51例初诊SAA/VSAA患者疾病特征与红细胞寿命的关系进行了研究，对包括人口学和血液学多种参数进行单因素分析，未发现与红细胞寿命相关的变量。提示初诊SAA/VSAA患者红细胞寿命缩短可能与AA基本病理生理过程相关，为疾病本身特征性改变，与性别、年龄、病因等因素无关。而从属于疾病严重程度、微小PNH克隆等特性之间红细胞寿命亦无差异，可能与纳入患者相对均一和样本量较小有关。ROC曲线分析显示红细胞寿命与IST疗效预测作用界值为60 d，敏感性和特异性分别为37.5%和86.4%。以治疗前红细胞寿命60 d为分界比较不同红细胞寿命分组对IST后3个月疗效影响，9例治疗前红细胞寿命>60 d，IST后3个月HR 6例，NR 3例；29例红细胞寿命≤60 d，IST后3个月HR 10例，NR 19例（P=0.128）。可能与样本量较小相关，宜进一步增加样本量验证治疗前红细胞寿命是否可预测IST疗效。

AA患者红细胞寿命缩短的机制不清。研究显示，CAA红细胞寿命缩短与红细胞在脾脏破坏过多^[17]及红细胞膜结构的内在质量、膜蛋白的含量、分布改变继而使红细胞膜的稳定性、形态和变形性改变，导致红细胞寿命缩短直接相关^[19]。本研究结果显示，IST后HR患者较NR患者血清IL-2R和IL-6水平明显减低。提示红细胞寿命可能与淋巴细胞因子水平异常改变有关，这与慢性病贫血炎性细胞因子增多引致红细胞寿命缩短机制相一致。Gardenghi等^[20]研究发现，在热杀伤布氏杆菌诱导的炎性贫血小鼠模型，单核巨噬细胞吞噬红细胞现象较正常对照小鼠明显常见，以脾脏噬血细胞现象表现最为明显。在其他许多类型的炎性状态下也都观察到这种单核巨噬细胞系统吞噬红细胞现象增加、红细胞寿命缩短^[21,22]。细胞因子激活单核巨噬细胞系统，使红细胞被过多吞噬、分解，红细胞寿命可缩短40%，被认为与炎性贫血的发生有关^[21,23]。我们认为AA是兼有炎性贫血特征的骨髓造血衰竭，其贫血的发生是以骨髓红系造血减少为基本改变、红细胞寿命缩短参与共同作用的结果。本研究结果显示，IST后HR患者除外周血三系血细胞参数明显升高提示恢复自身骨髓造血外，随着多种细胞因子水平下降红细胞寿命也明显延长或恢复正常，支持这种假设。

IST后SAA/VSAA患者红细胞寿命可改善或恢复正常，表明AA残存造血干祖细胞所生成的红细胞内在质量并无明显异常。在本研究中，HR患者红细胞寿命和IL-6等细胞因子水平都较NR患者明显改善。并且疗效质量与红细胞寿命改善程度相关，获得CR者红细胞寿命恢复正常，GPR者明显改善，而NR者与初诊患者一致，仍明显缩短。提示在现有标准治疗方案下，SAA/VSAA患者IST疗效的获得可能与病患个体异常免疫能否得以有效控制相关。鉴于红细胞寿命缩短与炎性细胞因子激活单核巨噬细胞有关，因而，检测这一参数IST前后变化可能反映AA异常免疫是否得以控制。

总之，以内源性CO的呼气试验方法研究红细胞寿命结果表明，AA患者红细胞寿命缩短，经IST可改善或恢复正常；淋巴细胞因子水平升高可能与AA红细胞寿命缩短有关。AA是兼有炎性贫血特征的骨髓造血衰竭。

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