红细胞寿命检测方法及其应用的研究进展
杨健萍 叶铁真
510623 广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心血液肿瘤科
通信作者：叶铁真，Email：yetiezhen@163.com
DOI：10.3760/cma.j.issn.1673—419X.2016.05.013
【摘要】红细胞寿命(RBCS)检测有助于了解各类型贫血及红细胞破坏的原因，更是溶血性贫血的诊断“金标准”。然而，迄今仍无一项技术手段可广泛应用于临床RBCS检测。本文在简要介绍红细胞清除机制的基础上，对51Cr标记法、15N-甘氨酸标记法和生物素标记法等几种常见RBCS检测方法的原理、检测步骤、临床应用及其利弊作一综述，并且重点介绍一种具有临床应用前景的RBCS检测方法--一氧化碳(C0)呼气试验。
【关键词】红细胞衰老； 铬放射性同位素； 生物素； 一氧化碳
Research progress of measurement methods of red blood cell survival and their applications Yang Jianping,Ye Tiezhen
Department of Hematology and Oncology，Guangzhou Women and Children's Medical Center,Guangzhou Medical University，Guangzhou 510623，Guangdong Province，China Corresponding author：Ye Tiezhen，Email：yetiezhen@163.com
[Abstract]The measurement Of red blood eell survival(RBCS)can help to understand the causes of various anemia and red blood cell breakdown，even more，it is the "gold standard" for the diagnosis of hemolytic anemia.However，so far，there is no appropriate method can be widely used in clinical for RBCS measurement.Here，we brief describ the mechanisms of red blood cells removing firstly，summarize the theory，detection steps，clinical applications，advantages and disadvantages of several measurement methods，such as 51Cr label，15N—glycine label and biotin label，etc..Then we focus on carbon monoxide(C0)breath test，a new method of RBCS measurement which had a broad scope in future clinical application.
[Key words]Erythrocyte aging；Chromium radioisotopes；Biotin；Carbon monoxide
红细胞寿命(red blood cell survival，RBcs)是指红细胞从骨髓释放人外周血液循环后至被网状内皮系统清除所经历的时间。RBCS是机体一项重要的生理指标，是判断红细胞病理、生理变化的重要基础。准确测定RBCS有助于了解各类型贫血及红细胞破坏的原因，更是溶血性贫血的诊断“金标准”。然而，目前由于检测方法的限制，RBCS检测仍难以广泛应用于临床。本文就RBCS检测方法的研究进展及其在临床的应用前景综述如下。
1 红细胞清除机制正常成熟红细胞在血液循环中的寿命为70～140 d，平均约为115 d[1]。正常情况下，红细胞的清除是非随机性的，这意味着同一时期生成的红细胞的衰老程度相近，并且大约在同一时间被网状内皮系统清除[2]。有关衰老红细胞被网状内皮系统清除的机制，一直是相关学者研究的热点，但是迄今尚无定论。目前，研究者普遍认为在红细胞衰老过程中，其表面会出现下列主要的特征性变化。
1.1 带3蛋白修饰
带3蛋白(band 3 protein)为红细胞跨膜蛋白，其跨膜部分的主要功能是调节细胞内外的阴离子交换，并被自身抗体识别；其在细胞质的部分则通过与不同的蛋白质结合，从而调节红细胞的结构与功能[3]。衰老红细胞膜表面带3蛋白单体分解和(或)聚集形成二聚体或四聚体，由此产生一种新的抗原，有研究者称其为衰老细胞抗原。衰老细胞抗原可与血清中的自身抗体免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G结合形成抗原一抗体复合物，后者最后被肝及脾的巨噬细胞吞噬。上述衰老红细胞清除机制提示，带3蛋白的结构变化可能是机体清除衰老红细胞进程的关键步骤[4-5]。Kay等[5]将12只大鼠平均分为维生素E增高组、维生素E正常组和维生素E缺乏组，采用免疫印迹法分别检测3组大鼠红细胞膜带3蛋白分解产物，结果显示维生素E缺乏组大鼠的带3蛋白分解产物数量增加，该作者由此结果推断，红细胞氧化可能是红细胞衰老和衰老细胞抗原产生的原因。
1.2膜磷脂酰丝氨酸暴露
1994年Connor等[6]首次提出膜磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)的暴露与机体清除衰老红细胞有关。此后，这一观点得到多项研究结果的证实[7-8]。这些研究结果均显示，正常红细胞的PS存在于细胞膜内部，随着红细胞的不断衰老，PS逐渐暴露于细胞膜表面，其可被巨噬细胞的CD36受体识别，并且被巨噬细胞吞噬[7-8]。但是，2008年Khandelwal和Saxena[9]的研究却得出相反结果，他们利用流式细胞仪(flow cytometry，FCM)检测以脂溶性X-羟基琥珀酰亚胺-生物素标记的小鼠红细胞，结果显示，在刚释放入血液循环的年轻红细胞中，PS+红细胞的检出率为3％～4％，但是随着红细胞的衰老，PS+红细胞检出率并未升高，而是迅速降低，并维持于1％以下，该结果提示红细胞PS的暴露可能与衰老红细胞的清除无关。
1.3衰老红细胞表达CD47水平降低
2002年，Fossati-Jimaek等[10]研究结果显示，小鼠衰老红细胞的CD47表达水平较年轻红细胞减少约20％，因此推测CD47表达水平降低可能是机体清除衰老红细胞的机制之一。随后的研究结果也进一步解释了CD47表达水平降低的原因，即红细胞表达的CD47可与巨噬细胞表达的信号调节蛋白(signal regulatory protein，SIRP)α结合，并且释放抑制性信号，从而阻止红细胞被巨噬细胞吞噬[3]。
2 直接测定红细胞寿命的方法
直接测定RBCS是利用不同的标志物标记红细胞，检测这些标志物在不同时间点时数量的变化，据此标绘标准曲线，以此推算RBCS。
根据被标记的红细胞亚群不同，RBCS直接测定方法可分为[2,11-13]：①同龄标记(cohort labels)：即标记某一确定时间段内从骨髓释放到外周血的新生红细胞，因此受检红细胞日龄相仿。常用于此法的标志物有59Fe、14C、15N等；②全龄标记，又称为群体标记(population labels)或随机标记(random labels)法：即标记外周循环血液中所有日龄的红细胞，常用于此法的标志物有51Cr、99Tc、DF32P(diisopropyl—fluorophosphate)、生物素等。根据标记红细胞的标志物不同，RBCS直接测定的方法又可分为放射性同位素法、非放射性同位素法和生物素法。
2.1 放射性同位素标记法常用于标记红细胞的放射性同位素包括51Cr、99Tc和DF32P，其中51Cr最为常用[2]。利用51Cr标记法测量RBCS首先由Gray和Sterling[14]于1950年提出，并且该方法经过不断改进，曾得到较为广泛的应用。51Cr标记法基本原理是：在体外51Cr以放射性铬酸钠(Na：51CrO4。)的形式与红细胞结合，即含有六价铬的铬酸盐阴离子通过阴离子通道进入红细胞，与血红蛋白(hemoglobin，Hb)非共价结合，随后六价铬被还原成三价铬，从而完成51Cr对红细胞的标记[11]。51Cr标记法的具体步骤：①将被51Cr标记的红细胞回输入检测对象体内后，在不同时间点采集受血者外周血，并且采用闪烁计数器测量上述不同时间点血液标本的放射性；②以回输后24 h所采集的第1份血液标本的放射性计数值作为基础，其后时间点采集标本的放射性与其相比较，即可求得各个时间点红细胞的生存百分数；③以红细胞的生存百分数(％)为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制红细胞的存活曲线，即可通过该曲线推算受血者的RBCS。51Cr标记的红细胞回输后，51Cr以每天约1％的相对恒定速率从标记的红细胞上脱落，并且由于三价铬不能再次进入红细胞，所以脱落的51Cr不会再标记其他红细胞，因此51Cr标记法所测得RBCS需要采用校正系数表进行校正[1-2]。
51Cr标记法的优点包括：①从已标记红细胞上脱落的51Cr不会再次标记其他红细胞，因此可避免由于51Cr重复标记红细胞而对检测结果产生影响[1-2,11]；②检测结果重复性好，该方法曾一度被视为RBCS的检测“金标准”，并且成为临床诊断溶血性疾病的实验室检测指标之一[15]。
但是51Cr标记法也存在下列缺陷：①需多次采集检测对象的外周血；②一次只能检测某一日龄的红细胞群体；③51Cr脱落率在不同血液病患者之间存在差异[16]；④操作繁琐，测定周期长；⑤具有放射性危害，不宜用于胎儿、儿童和孕妇的RBCS检测；⑥须对放射性废弃物进行处理，导致该方法的检测成本增加[1]。因此，目前全国各医院均已终止该检查项目，国外也罕有医院使用[1]。
Uehida等[16]选择42例不同血液病患者作为研究对象，纳入血液病组；并且选择12例血液学指标正常的健康个体作为对照组，比较2组受试者采用51Cr与DF32P标记法检测平均红细胞寿命(mean red cell life_span，MCL)的结果，并且比较51Cr标记红细胞时51Cr的脱落率。该研究结果显示：①对照组12例健康个体通过校正51Cr标记法测得的MCL值为(102.1±10.8)d，采用DF32P标记法测得的MCL值为(111.3±9.1)d，二者比较，差异无统计学意义(P>0.05)；②对照组51Cr脱落率为每天(1.44±0.18)％，血液病组51Cr脱落率为每天0.13％～2.32％，其中再生障碍性贫血患者为(0.66±0.47)％，骨髓增殖性疾病患者为(1.10±0.24)％，缺铁性贫血患者为(1.13土0.57)％，白血病和淋巴瘤患者为(1.21±0.50)％，遗传性球形红细胞症患者为(1.22±0.13)％，先天性血小板减少性紫癜患者为(1.82±0.08)％，充血性脾大患者为(2.14±0.77)％，自身免疫性溶血性贫血患者为(5.31±2.62)％，而且后两种疾病患者的51Cr脱落率显著高于对照组(P<0.05)。
2.2 非放射性同位素标记法
目前使用的非放射性同位素中，50Cr的检测因需要进行质谱分析或色谱分析，检测成本较高、技术难度较大，因此其临床应用受到限制[2]。
15N-甘氨酸标记属于同龄标记。由于Hb的4个氮原子均来源于甘氨酸[17]，故15N-甘氨酸作为底物参与整个幼红细胞时期Hb的合成，从而完成15N-甘氨酸对幼红细胞的标记。被标记的幼红细胞发育成网织红细胞并释放入外周血液循环，随后分化为成熟红细胞。因此，随着红细胞的成熟，其细胞内的15N-甘氨酸水平逐渐增高。有研究结果显示，红细胞内的15N-甘氨酸在标记后2.8～6.3 d达到标志物总量的50％，于标记后20～25 d达到峰值[1]。
15N-甘氨酸标记法的优点包括：①可克服放射性同位素的弊端，标记过程安全、简便；②适用于胎儿JL童和孕妇的RBCS检测；③可通过13服给药标记体内红细胞[1]，这是本法最突出的优点。
但是，此法也存在以下缺点：①15N-甘氨酸除可标记Hb外，还可能标记其他蛋白质，并可被新产生的红细胞再利用，从而影响检测结果；②需要通过质谱分析仪进行检测。
2.3 生物素标记法
1987年Suzuki和Dale[18]首次建立生物素标记红细胞的方法。1991年Hoffmann-Fezer等[19]进一步证明生物素标记可用于评估RBCS。常用的生物素有N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)-生物素，硫代-NHS-生物素。生物素在体外通过与红细胞膜蛋白共价结合的方式标记红细胞[1]。将被生物素标记的红细胞(biotinylated red blood cells，BioRBC)回输至检测对象体内后，在不同时间点采集外周血，然后利用生物素与抗生物素蛋白之间的高亲和力，使BioRBC与含有荧光素的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白特异结合[20]，然后采用FCM检测血液样本中带有荧光素的BioRBC数目，并计算不同采血时间点BioRBC占总红细胞数的百分比。以回输机体后1～2 h所采集的第1份血液标本的BioRBC百分比为基础，其后时间点采集标本的BioRBC百分比与其相比较，即可求得各个时间点红细胞的存活率。以红细胞的存活率(％)为纵坐标，时间(d)为横坐标，绘制红细胞的存活曲线，由此推算受试者的RBCS。
以生物素作为标志物，除具有上述非放射性同位素标记的优点外，还具有自身特有的优势：①生物素标记的方法十分有利于应用FCM检测被标记的红细胞在循环血液中的存活时间；②因为生物素与膜蛋白共价结合，所以很少从红细胞上脱落；即使出现少量脱落，由于血浆中存在活性生物素激酶，利用FCM仍可检出生物素，因此该方法由于标志物脱落而对检测结果的影响较小[20]；③可以利用不同浓度的同一种生物素，或利用不同种类的生物素同时标记多个日龄的红细胞群体，从而检测不同群体的RBCS[15,21-24]。
该方法的缺点是：①检测过程耗时较长；②需要多次洗涤被标记的红细胞，以去除未反应的试剂和副反应产物；③由于生物素是一种异体蛋白，存在引发变态反应的潜在风险[20]。
为比较不同浓度的生物素对检测结果的影响，Mock等[15]将8例健康成年人平均分为4个组，分别采用6、18、54和162 mg/mL 4个不同浓度的硫代-琥珀酰亚胺-生物素在体外标记其红细胞，然后将生物标记的红细胞分别回输入受试者体内，并对其回输24 h后红细胞回收率(post-transfusion recovery of red blood cells after 24 hours in the circulation，PTR24)，标记后的红细胞在外周血中减半所需的时间(time to disappearanceof 50 percent of the labeled red blood cells from the circulation，T50)和平均潜在寿命(mean potential life span，MPL)进行检测。结果显示：①4个不同浓度生物素组的PTR24。分别为(99.O±3.2)％、(97.9±3.6)％、(98.4±2.1)％和(96.3±5.2)％，4组PTR24比较差异无统计学意义(P>0.05)，该结果提示4种不同浓度的硫代-琥珀酰亚胺-生物素均可独立且准确地测量PTR24；②6和18 mg/mL生物素组的T50分别为(58±4)d和(57±4)d，该结果与51Cr标记法校正后测得的T50[(52±4)d][25]比较，差异无统计学意义(P>0.05)，MPL分别为(115±8)d和(113±9)d与51Cr标记法校正后测得的MPL[(116±16)d][25]比较，差异亦无统计学意义(P>O.05)，该结果提示低浓度硫代-琥珀酰亚胺-生物素可准确反映长期RBCS；③54和162 mg/mL生物素组的T50和MPL较低浓度生物素组显著降低，提示高浓度硫代-琥珀酰亚胺-生物素会缩短长期RBCS的检测结果。
3 间接测定红细胞寿命的方法
间接测定红细胞是通过检测机体排泄物中红细胞的破坏产物，如胆红素、铁元素等，推算RBCS。由于受肝胆、胃肠、肾功能等诸多因素影响，不同个体检测结果差异较大，所以既往对此法的研究较少，几乎未用于临床。近年，有研究者建立了通过检测受试者呼出气体中一氧化碳(carbon monoxide，CO)浓度推算其RBCS的方法，以下简称“CO呼气试验”。该方法经过多年来不断地改进，已可应用于临床。
3.1一氧化碳呼气试验的基本原理
人体呼出气体中的CO主要由内源性CO和外源性CO组成。内源性CO来源于Hb降解(占86％以上)和非Hb代谢(不超过14％)，而来源于Hb降解的CO中，85％又来自红细胞降解，15％来自非红细胞Hb。因此，人体呼出气体的内源性CO中，约70％来自于红细胞降解。当Hb分解为胆红素时，Hb中的α-亚甲基碳生成CO，即1个Hb产生1个CO分子。因此，在排除外源性CO干扰的前提下，可由机体呼出气体的内源性CO浓度推算出红细胞的代谢速度心[26-27]。
根据Strocchi[28]等的研究结果，当机体红细胞处于生成速度等于破坏速度的稳态时，或者说Hb处于合成速度等于分解速度时，可通过检测呼出气体的内源性CO浓度和外周血Hb浓度，并根据下列公式计算RBCS：RBCS(d)-外周血Hb水平×1 380/内源性C0浓度。
3.2一氧化碳呼气试验检测RBCS的方法
最初测量呼出气体中内源性CO产生量的方法，是让受试者在一个有规律地排出CO2和输入02的封闭系统中重复呼吸数小时，并观察该系统中CO的增加速率直到CO稳定增加。
1992年，Strocchi等[28]报道了一种简化的方法代替繁琐的重复呼吸方法，即利用一种模拟人体内CO平衡的装置，扣除受检气体中的外源性CO，从而得到内源性CO浓度。
1999年，加拿大的Natus Medical公司研发了适用于新生儿JL童的测量呼气末CO(end-tidal carbon monoxide，ETCO)的分析仪，并命名为“Natus CO-Stat End TidalBreathAnalyzer”[29]。
2003年，Furne等[30]发现，由于环境中的CO浓度是十分稳定的,在收集呼出气体的同时，采集同一环境下的气体，然后同时测量呼出气体和环境气体的CO浓度，可校正呼出气体中的外源性CO。据此，建立了一种简单、快速、无创的测量呼出气体中内源性CO浓度，并据此推算RBCS的方法。该作者应用该方法检测40例健康成年人呼出气体中的CO浓度，计算出RBCS为(122±23)d，与既往报道的同龄标记法检测RBCS的结果相近。
3.3一氧化碳呼气试验的临床应用
多项研究结果表明，溶血性疾病患者ETCO浓度升高。James等[31]选择21例地中海贫血患者(儿童患者为15例，成年患者为6例)，18例镰状细胞贫血(sickle cell anemia，SCA)患者(儿童患者为16例，成年患者为2例)和62例健康个体(儿童为27例，成年人为35例)为研究对象，检测其ETCO浓度，结果显示，SCA患者ETCO浓度最高，地中海贫血患者次之，健康个体最低。该结果与Lal等[32]的研究结果相近：16例SCA患儿的ETCO浓度为(4.85±2.24)ppm明显高于16例正常儿童[(0.96±0.54)ppm]；并且SCA患者中严重贫血(Hb<8 g/dL)患儿的平均ETCO浓度为5.43 ppm高于贫血程度较轻者(4.40 ppm)。Christensen等[33]研究结果显示，20例不同原因所致溶血的新生儿及儿童的ETCO浓度显著高于20例年龄与之匹配的健康儿童(P<0.000 1)。Christensen等[34]通过检测100例黄疸新生儿的ETCO浓度，发现37例患儿的ETCO浓度升高，其中1l例患儿发生ABO溶血，其余26例发生不同原因所致的溶血。上述研究结果均提示，ETCO浓度可用于识别贫血患者的溶血反应，并监测溶血的严重程度。
Blok等[35]检测69例早产儿出生后24 h内的ETCO浓度，并随访其3岁6个月时的神经发育情况，结果显示，受试儿童中3岁6个月时神经发育不良者，出生后24 h内的ETCO浓度显著高于神经发育良好者[(2.7±0.7)ppm比(2.0±0.5)ppm，P 抗病毒药物利巴韦林的不良反应之一是贫血。为探讨利巴韦林引起贫血的机制，Virtue等[36]胡选择18例丙型肝炎患者作为研究对象，其中13例正在接受利巴韦林治疗，5例未使用利巴韦林治疗，通过CO呼气试验测量受试者RBCS，并且以40例健康志愿者作为对照组。结果显示，接受利巴韦林治疗的丙型肝炎患者中，92.31％出现贫血，其RBCS为(46±14)d，仅为健康对照者[(122±23)d]的38％；5例未使用利巴韦林治疗的丙型肝炎患者的RBCS均在正常范围内[(112±16)d]。该结果提示，利巴韦林所致的贫血的原因是红细胞破坏增加。 Mitlyog等[37]对21例类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者，18例骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者和25例因各种慢性疾病而导致贫血的患者进行CO呼气试验测量其RBCS。结果显示，RA组的RBl笃为(90±15)d，各种慢性疾病所致贫血组的RBCs为(87±33)d，较健康个体的(122±23)d及OA患者的(127±25)d显著缩短(P<0.001)。这提示，RA和各种慢性疾病所致的贫血，与麟缩短有关；而RA患者的Hb水平接近正常，说明RA患者骨髓造血代偿能功能较强。 Mitlyng等[36]进行的另一项研究探讨人工心脏瓣膜对RBCS的影响。该作者对20例植入机械瓣膜患者和18例植人人造生物瓣膜患者进行CO呼气试验测量其RBCS。结果显示，机械瓣膜患者的RBCS为(99±23)d，人造生物瓣膜患者的RBCS为(103±15)d，两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但均较健康个体的[(122±23)d]显著缩短(P<0.01)，而两组患者的Hb水平均在正常参考值范围内，这提示植入人工心脏瓣膜引起的溶血可通过刺激骨髓造血功能得以代偿。 多数新生儿可于生后数天发生黄疸，并且部分发展为新生儿高胆红素血症，极少数还可发生高胆红素相关神经发育异常，但是，目前胆红素相关神经发育异常的发生机制尚未明确。包括大样本队列研究在内的数项研究结果提示，伴溶血的新生儿高胆红素血症患儿，发生神经发育异常的风险更大[39-40]。因此，对于新生儿黄疸，溶血是一项重要的危险度分层评估指标。新生儿溶血的原因多样，并且尚无统一的诊断标准。美国儿科学会高胆红素血症学组指出，CO呼气试验检测RBCS在新生儿高胆红素血症鉴别诊断中的应用，应引起更多的关注[41]。 3.4一氧化碳呼气试验的优缺点 与直接测定红细胞寿命的方法相比，通过CO呼气试验检测RBCS具有以下优点：①简易、快速，仅需1 h甚至更短时间即可获取结果；②无创伤，便于重复检测；③准确度和灵敏度高，可准确反映疾病的严重程度。而该法的缺点是：吸烟及肺功能受损者的检测结果等可能受到影响，因此，本法不适用于此类人群。 4 小结 综上所述，在目前已有的RBCS检测方法中，51Cr或生物素标记法由于存在耗时长、操作繁琐，或需多次采血，或需使用发射性同位素等问题，限制了其在临床上的使用。而通过CO呼气试验检测RBCS，则因其具有无创伤、无辐射、简易、快速、准确等优点，为RBCS测定带来了新的突破，可望广泛应用于临床，并有望为修订贫血的鉴别诊断思路提供具有指向性的、有力的实验室检测手段。 利益冲突 无 5 参考文献 [1] Franco RS.Measurement of red cell lifespan and aging[J].Transfus Med Hemother，2012，39(5)：302-307.DOI：10。1159/000342232. 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